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极彩登陆-百晓生 | 怎么在心脏中找到初级纤毛,并验证疾病机制

admin 2019-05-24 227人围观 ,发现0个评论

解螺旋大众号陪同你科研的第1825天

初级纤毛:一种成纤维细胞促心肌纤维化的重要细胞器。

纤毛是一种突出于细胞外表的呈毛发状的细胞器,依据结构和功用可分为运动纤毛和初级纤毛。运动纤毛的功用首要是帮忙细胞运动;而初级纤毛则停止不动,对细胞外信号具有敏锐的感知才能,是细胞表里信号传递的途径。

早在1898年研讨人员发现了初级纤毛,而直至在曩昔10年中,一些研讨清晰证明了初级纤毛在传递流体活动、压力、激素、代谢物和生长因子等信号的要害效果,因此引起了科研人员对初级纤毛的爱好。初级纤毛存在于神经元、前脂肪细胞和肾小管细胞等多种停止细胞中,而且参加增殖、分解和细胞周期等多种细胞病理生理进程。

现阶段,初级纤毛在心血管范畴的研讨寥寥可数,其对心血管的效果尚待阐明。尽管1970年代的一项开创性研讨报导人心脏安排中含有纤毛,但心脏中纤毛的特定方位和功用均未曾阐明。尽管已有研讨者发现纤毛与心脏发育显着相关,小鼠纤毛缺点可引起先天性心脏病,但成人心脏中初级纤毛的效果没有见报导。

本文的研讨者发现Bardet-Bied极彩登陆-百晓生 | 怎么在心脏中找到初级纤毛,并验证疾病机制l综合征和常染色体显性多囊肾病等多种以初级纤毛功用障碍或结构改动为特征的纤缺点随同多种心血管疾病(如主动脉瓣发育不全)这一现象,猜测初级纤毛与心脏发育及病理改动密切相关,所以探究了初级纤毛在心脏中的详细方位及其在多种心脏疾病中的详细效果机制。

为验证心脏中存在初级纤毛,研讨者首先在重生小鼠和成年小鼠心脏检测并发现了初级纤毛。因为初级纤毛在很大程度上影响小鼠的发育,研讨人员接着检测了不同发育阶段的小鼠胚胎心脏中初级纤毛,并发现了初级纤毛的存在。

运用免疫荧光共定位的原理,研讨者发现心脏中的初级纤毛不存在于心肌细胞中(图 1)。为进一步证明这一发现,研讨者特异性敲除小鼠心肌细胞中的KIF3A(一种对初级纤毛构成至关重要的蛋白),发现仍能观察到心肌安排中有初级纤毛。接着研讨者在重生大鼠和成年大鼠也检测到了初级纤毛,相同发现初级纤毛不存在于心肌细胞中(图 2)。

图1 初级纤毛存在于小鼠心脏中。(A)取1周龄和10周龄雄性C57BL/6小鼠的心脏,白腊包埋,并用乙酰化微管蛋白(赤色)和-MHC(绿色)进行免疫染色(份额尺:20m)。(B)是(A)的3D重建图画。(C和D)别离在小鼠胚胎期的第9.5天、10.5天、11.5天12.5天和15.5天(别离表明为E9.5、E10.5、E11.5、E12.5和E15.5)取胚胎。然后将胚胎进行白腊包埋,用乙酰化微管蛋白(赤色)和肌钙蛋白I(绿色,心肌细胞符号物)进行免疫荧光染色。细胞核用DAPI(蓝色)(100g/mL)染色,用共集合显微镜搜集代表性图画(n= 3)。白色箭头指示纤毛细胞的方位。RA代表右心房,LA代表左心房,LV代表左心室,RV代表右心室(份额尺:50和20m)。

图2初级纤毛存在于大鼠心脏的成纤维细胞中。培育原代重生大鼠心脏成纤维细胞(NRCF)(A)和成年大鼠心脏成纤维细胞(ARCF)(B),并用免疫荧光法检测波形蛋白、乙酰化微管蛋白、-微管蛋白、PC1、PC2和KIF3A的表达(A-C)。细胞核用DAPI染色(100g/ mL)。用共集合显微镜获取代表性图画(份额尺:20和5m)。白色箭头指示-微管蛋白符号的纤毛的基底部。

为清晰初级纤毛是否参加心肌损害后的重极彩登陆-百晓生 | 怎么在心脏中找到初级纤毛,并验证疾病机制塑进程及存在于何种细胞类型中,研讨者在3种动物模型(心肌缺血再灌注损害模型、心尖切除模型和心肌梗死模型)中检测了初级纤毛,并对其进行定位。在心肌缺血再灌注损害后,梗死区富集了具有初级纤毛结构的细胞,经检测该细胞很可能是成纤维细胞(图3A-B)。

相同,在心尖切除后的创伤处具有初级纤毛结构的细胞显着添加,而该细胞并不是心肌细胞(图3C)。在心肌梗死模型相同存在具有初级纤毛结构的细胞在梗死周边区很多添加的现象,为清晰细胞类型,研讨者检测了巨噬细胞、内皮细胞和肌成纤维细胞(激活后的成纤维细胞),成果发现该具有初级纤毛结构的细胞是肌成纤维细胞(图3D-G)。

除了体内试验外,研讨者挑选成年大鼠心室肌细胞(ARVM)、重生大鼠心室肌细胞(NRVM)、成年大鼠心脏成纤维细胞(ARCF)、小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及人主动脉内皮细胞(HAEC)进行了体内试验,检测初级纤毛,成果发现只要ARCF具有初级纤毛结构。

为使试验成果更具说服力,研讨者搜集了6名心脏移植手术患者的心肌安排进行切片染色,发现梗死周边区的构成初级纤毛结构的细胞是成纤维细胞(图3H-I)。

图3具有初级纤毛结构的细胞集合在损害心肌周围。取10-12周龄的小鼠行心肌缺血再灌注手术。在阻断心肌血流(I)45分钟后使血管再通(R),并于术后4天、7天和14天选材。假手术用作对照。

(A)在心脏水平方向的切片中进行Masson三色染色,评价胶原堆积改动(份额尺:1mm)。(B)经过免疫染色评价来自(A)心脏样品的纤毛细胞。乙酰化微管蛋白用作纤毛的符号物;波形蛋白用作成纤维细胞符号物。白色箭头表明纤毛(份额尺:20和5m)。(C)对7日龄的C57BL/6小鼠行心尖切除手术。术后7天取心脏,经过免疫荧光法检测乙酰化微管蛋白评价纤毛。肌钙蛋白I用作心肌细胞符号物。(D-F)对10-12周龄雄性C57BL/6小鼠行心肌梗死手术,并于术后7天取心脏,用乙酰化的微管蛋白评价瘢痕区的纤毛。(D)-SMA用作肌成纤维细胞符号物。(E)CD68染色用作巨噬细胞符号物,(F)CD31用作内皮细胞符号物(份额尺:20m)。(G)D-F中显现的具有纤毛的-SMA、CD68和CD31阳性细胞的定量计算。数据表明为均匀百分比规范误,运用单要素方差剖析及Dunnet查验进行组间比较,***代表与-SMA组比较,p<0.001(n=3-4).(H和I)人的心脏样品是在6名IV期心力衰竭患者进行心脏移植时取得的。该样品被用来进行马松三色染色(H)评价纤维化(份额尺:800m)和免疫荧光染色(I)评价细胞的纤毛(用乙酰化微管蛋白符号);波形蛋白用作成纤维细胞符号物(份额尺:20m)。一切图画均用DAPI(100g/mL)或Hoechst(1g/mL)染细胞核,而且每组均有3-4个样本的代表性图片被拍照。图画均用共集合显微镜拍照。白色箭头代表具有纤毛结构的细胞。

鉴于心脏成纤维细胞在心肌损害后首要发挥促心肌纤维化的效果,所以研讨者猜测初级纤毛对成纤维细胞的促心肌纤维化起着要害效果。因为TGF1是心脏成纤维细胞发作纤维化的要害,所以研讨者运用TGF-1诱导体外成纤维细胞模仿体内纤维化进程。

运用TGF-1处理重生大鼠成纤维细胞(NRCF)和ARCF发现TGF-1处理后具有初级纤毛结构的细胞份额显着添加,并发现与初级纤毛传导信号相关的分子PC1和PC2、与初级纤毛构成相关的KIF3A均参加成纤维细胞初级纤毛的构成(图2C)。

成纤维细胞的排泄细胞外基质蛋白、活化、粘附、搬迁和侵袭等特性均与心肌纤维化有关。为研讨初级纤毛调控成纤维细胞纤维化的机制,研讨者对NRCF细胞中的PC1、PC2和KIF3A别离进行敲减,随后用TGF-1处理,发现PC1和KIF3A均促进细胞外基质蛋白纤连蛋白、胶原I和胶原III的转录,PC2却不影响,提示初级纤毛参加成纤维细胞排泄细胞外基质蛋白的进程(图4A-B,E-G)。

接下来,研讨者研讨了初级纤毛在成纤维细胞活化中的效果,发现在ARCF细胞中缄默沉静IFT88(一种对纤毛功用及其构成十分重要的蛋白)能够显着削减胶原I和-SMA(肌成纤维细胞的一种标志)的生成,在NRCF中敲除PC1能够显着削弱-SMA的表达及细胞的缩短功用,阐明初级纤毛参加成纤维细胞向肌成纤维细胞的分解及人生八苦后者的缩短(图4H-L)。

因为心肌损害后的心肌纤维化还与成纤维极彩登陆-百晓生 | 怎么在心脏中找到初级纤毛,并验证疾病机制细胞的粘附、搬迁和侵袭密切相关,所以研讨者对敲除了KIF3A或PC1的ARCF细胞进行TGF-1诱导,发现初级纤毛与心肌成纤维细胞的粘附、搬迁和侵袭无关。

图4初级纤毛及其功用蛋白PC1是TGF-1诱导的心肌纤维化的必要条件。(A和B)培育NRCF,用特异性siRNA缄默沉静PC1,PC2和KIF3A,非特异性siRNA(UNR)作为对照。然后用10ng/mLTGF-1处理48小时,提总蛋白质或RNA。(A)用蛋白质印迹检测I型胶原、KIF3A和PC2,GAPDH作为内参。A是三个样本的代表图。B是A的定量剖析。数据表明为均匀值规范误,选用双变量方差剖析和Tukey查验计算组间差异。*代表p<0.05,n=3个独立的细胞培育物。(C和D)在ARCF中缄默沉静PC1。(C)用蛋白质印迹检测用特异性靶向PC1的siRNA处理36小时后的PC1蛋白水平(FL:全长PC1,NTF:N端PC1)。(D)是C的均匀光密度定量成果。数据显现为均匀值规范误,运用独立样本t查验,*表明与UNR比较p<0.05。(E-G)经过RT-qPCR法对纤连蛋白(E),胶原蛋白I(F)和胶原蛋白III(G)的转录水平进行剖析,Pabpn作为内参。将成果规范化为1,将数据描绘为均匀值规范误,运用双变量方差剖析和Tukey查验计算组间差异(n=5-7)。*代表p< 0.05。(H和I)培育ARCF,用2种siRNA缄默沉静IFT88,用10ng/ mLTGF-1处理48小时后提取总蛋白。(H)蛋白质印迹检测I型胶原、-SMA和IFT88的表达,GAPDH作为内参。(I)是H的定量成果。数据表明为均匀值规范误,选用双变量方差剖析和Tukey查验进行计算剖析,*代表p< 0.05;**代表p<0.01(n=3)。(J-K)别离用TGF-1或其溶剂处理用siRNA缄默沉静或未缄默沉静PC1的接种在胶原基质上的NRCF细胞48小时。(J)为胶原基质缩短的代表性图片,(K)为胶原基质面积的定量计算。胶原基质面积表明为均匀值规范误,选用双变量方差剖析和Tukey查验进行计算剖析,*代表p<0.05(n=3)。(L)用RT-qPCR法检测-SMA的转录水平,以18s作为内参。将成果规范化为1,并将数据表明为均匀值规范误,选用双变量方差剖析和Tukey查验进行计算剖析,*代表p<0.05(n= 5-7)。

在机制方面,因为SMAD蛋白是TGF-1诱导心肌纤维化所有必要的,而且初级纤毛参加TGF-1诱导心肌纤维化,所以研讨人员估测初级纤毛调理的纤维化必定也经SMAD蛋白发挥效果。所以研讨人员在ARCF和NRCF中敲除KIF3A或PC1,发现TGF-1诱导的SMAD3磷酸化水平显着下降,并观察到细胞核中的SMAD3显着削减(图5)。

图5初级纤毛及其功用蛋白PC1对TGF-1诱导的SMAD3活化是必需的。培育NRCF(A和B)和ARCF(C和D),用10ng/ mLTGF-1预处理30分钟,然后转染靶向于PC1或KIF3A的siRNA。(A和B)提蛋白,经过蛋白质印迹检测p-SMAD3和SMAD3。GAPDH用作内参。对条带进行定量并计算(B)。数据表明为均匀值规范误,以双要素方差剖析和Tukey查验计算组间及组内差异。*代表p<0.05 (n=4)。对用或许不必TGF-1预处理的ARCF(C)和用TGF-1预处理随后转染PC1或KIF3A的特异性siRNA的ARCF(D)行荧光双标(酰化微管蛋白(绿色)和p-SMAD3(赤色))检测。用DAPI(10ng/ mL)染细胞核,共集合显微镜获取代表性图画(份额尺:5m)。

在清晰初级纤毛及其功用蛋白(PC1、KIF3A等)在病理性心肌重塑进程中发挥的效果后,研讨人员经过构建基因敲除小鼠开端评价了该发现的临床转化价值。研讨者用到了2种肌成纤维细胞特异性敲除PC1的基因敲除小鼠,一种用TdTomato赤色荧光基团对肌成纤维细胞进行示踪,一种没有。

用这两种基因敲除小鼠树立心肌梗死模型,发现敲除PC1可显着削减心肌梗死面积及可溶性胶原,促进心肌肥厚,而对模型的存活率、心功用和心肌纤维化程度无显着影响(图6、7)极彩登陆-百晓生 | 怎么在心脏中找到初级纤毛,并验证疾病机制。

关于PC1的敲除未能改进心肌纤维化这一现象,研讨者提出:因为还没有发现仅存在与心脏成纤维细胞中的基因,在企图去除心脏成纤维细胞的纤毛时挑选存在于肌成纤维细胞中的骨膜素基因的发动子来驱动Cre重组酶,事实上这一战略去除的是被激活的成纤维细胞的纤毛,纤毛的去除时刻存在推迟,导致在阻断纤维化极彩登陆-百晓生 | 怎么在心脏中找到初级纤毛,并验证疾病机制之前就现已开端纤维化了。

图6成纤维细胞的PC1的特异性失活显着削减心肌梗死后心肌重构。(A)对8-12周龄雄性Pkd1f/f和Postn-Cre;PKD1f/极彩登陆-百晓生 | 怎么在心脏中找到初级纤毛,并验证疾病机制f小鼠行心肌梗死手术,术后7天取心脏。(B)用免疫荧光双标法(PC1C端抗体符号PC1,-SMA符号活化成纤维细胞)检测瘢痕区活化的成纤维细胞中PC1的表达(份额尺:20m)。用DAPI(100g/mL)染细胞核,用共集合显微镜获取图画(n=4)。(C)用马松三色染色检测纤维化和瘢痕巨细。运用玻片扫描仪获取代表性图画,n= 12(份额尺:1mm)。(D)计算C中瘢痕巨细。数据表明为均匀值规范差,运用独立样本t查验和Welch’s校对计算,n= 12。*代表p<0.05。(E)心脏分量/胫骨长度(HW/ TL)和(F)湿/干肺分量。数据表明为均匀值规范差,运用独立样本t查验和Welch’s校对计算,n=19-21。***表明p<0.001。(G)用超声心动图检测心脏缩短分数(FS),评价心室缩短功用。数据表明为均匀值规范差,运用独立样本t查验和Welch’s校对计算,n= 19-22。*代表p<0.05。(H和I)用小麦胚芽凝集素(WGA)染色评价心肌梗死后的心肌细胞横截面积(CSA)。(H)WGA染色的代表性图画。用共集合显微镜获取图画(份额尺20m)。(I)为(H)的定量计算成果。数据表明为均匀值规范差,运用独立样本t查验和Welch’s校对计算,n= 10-11。*代表p<0.05。

图7特异性敲除PC1后心肌梗死诱导的心脏瘢痕成分的改动。对8-12周龄雄性Pkd1f/f和Postn-Cre;PKD1f/f小鼠行心肌梗死手术,术后7天取心脏。(A)天狼星红染色评价远端、鸿沟和瘢痕区域的胶原堆积(份额尺:20m)。(B-D)对A中的纤维化区域进行定量计算。(E-H)提取瘢痕中的蛋白质,经过蛋白质印迹检测纤连蛋白、胶原蛋白I和-SMA的蛋白质水平,量化条带的灰度值并计算(F-H)。蛋白总量用作内参。(I)Sircol法测定瘢痕安排可溶性胶原水平。数据表明为均匀值规范误,选用独立样本t查验与Welch’s校对进行计算剖析,每组8-10个样本。*代表p<0.05。Pkd1即为PC1的基因名。

本文初次报导了原发纤毛存在于小鼠、大鼠和人类的心脏中,特别是在心脏成纤维细胞中,心肌细胞并不存在。在心脏成纤维细胞中,原发纤毛及其要害蛋白(KIF3A和PC1)经过添加细胞外基质生成、增强细胞缩短性并激活TGF-1-SMAD3信号轴调理心肌纤维化。该发现提醒了新的纤维化调理因子,为病理性心脏重塑的医治供给了新的有远景的分子靶标。

文章信息:

VILLALOBOSE, CRIOLLO A, SCHIATTARELLA G G, et al. Fibroblast Primary Cilia areRequired for Cardiac Fibrosis[J]. Circulation, 2019.

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